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【深度文章】制药洁净环境的真菌污染调查与溯源



在上一期,我们回顾FDA药品召回时,可以发现有不同类型的微生物与药品召回相关。除了革兰氏阴性细菌(如Burkholderia cepacia complex洋葱伯克霍尔德复合体)外,真菌污染也是召回的主要原因之一。(传送门
这类召回主要与非无菌药品相关,真菌污染可能导致药品的有效成分失活,药品保质期缩短,也可能威胁患者健康。导致真菌污染的原因主要有生产设施的设计缺陷、生产过程控制不足或材料缺陷。
接下去要给大家分享的这篇文章所要讨论的就是生产设施设计和运行问题引起的真菌污染。




文章主要内容

文中提到,在真菌引起的召回事件中,监管机构似乎更关注药品洁净室中的真菌污染问题。在GMP检查、FDA警告信等监管机构的调查报告中,药品洁净室、冷藏室和受控区域的真菌污染问题经常被提及。
洁净室需要特别关注真菌的原因,主要是它们会产生孢子,一旦在某个区域检测到这些孢子,就说明真菌孢子已经无处不在了。因为它们相对容易传播,且很难被清除。真菌主要有酵母、丝状真菌或同时具有前述两种状态的真菌,如白色念珠菌(被称为双相真菌)。
文章先回顾了一些召回事件,以便了解污染问题的背景,然后聚焦于真菌污染溯源,从真菌的特性、需要被关注的潜在污染区域、影响污染引入的可能因素等角度展开了一系列的研究,并对于制药生产环境监控中真菌污染呈现上升趋势的问题,提出了一些纠正措施和预防措施。


真菌污染引起的药品召回
在药品生产环境中的真菌可能来源于空气、水、人员和各种的原料。多年来,已有许多真菌问题在药品洁净室、冷藏室和受控区域被报道。无菌药品和非无菌药品均受到了影响。其中,最臭名昭著的无菌药品真菌污染案例可能是2012年的新英格兰合成药物中心受污染的药物导致脑膜炎疫情大爆发。
由于缺乏环境管控和设施设计,导致了如Exserohilum rostratum(嘴突脐孢) 、Aspergillus fumigatus (烟曲霉)以及洁净室常见的霉菌Cladosporium (芽枝霉属)的部分种等真菌的生长和繁殖。
不过,主要受影响的还是非无菌药品。下面列举了一些曾被召回产品的类型,信息主要来自FDA的警告信和其他的监管发文。曾被召回的产品类型主要包括:Aminocarproic糖浆、硫酸钡、阿米卡糖浆、Dial brand dialyte concentrate 、电解质溶液、干性护肤霜、酸性洗液、护肤霜、Preparation H软膏、Penecare乳液、Aidex 喷雾、药妆棉片、口服混悬液、VE绵羊油乳液、绵羊油身体乳、氟化钠漱口水、碳酸氢盐悬浮液、氨苄西林悬浮液、孕酮霜。
受影响的产品与不同类型的真菌有关。由于生产环境(地理位置等)和产品成分的差异,可能会造成某一些真菌菌种的生长超过另一些菌种。在一些案例中,产品污染菌与环境中分离到的真菌有一定的相关性。


与洁净室相关的真菌类型


文章作者根据国际文献总结了药品洁净室和药品中主要的真菌类型。虽然存在一定的区域性差异,但是真菌类型仍然存在着普遍的相似性。

这些真菌在外界环境中普遍存在且通过气流扩散。


小编:跟我们在2017-2018年年度报告中的分析到的常见真菌检出类型基本一致(传送门



对于进入制药环境的真菌,我们最关注的就是孢子的产生。真菌孢子是微小的生物颗粒,真菌产生孢子的原因有两个:第一个原因是真菌的繁殖需要,这个功能与植物的种子类似——尽管它们的机制不同。这些孢子的名称根据真菌的类型和生理状态的不同而不同。例如:孢囊孢子、接合孢子、子囊孢子等等。真菌通常根据其产孢结构分类,例如,子囊菌纲(ascomycetes)的特征就是孢子由一个子囊产生。子囊孢子的子囊是一个类似于“豌豆荚”的结构,它将孢子始终保持在最佳环境下,直到孢子被释放出来(包括酵母菌的孢子)。
真菌产生孢子的第二个原因是有一些真菌可以产生被称为厚壁孢子的特殊孢子(如念珠菌属、革耳菌属和被孢霉目的各个种)。这些真菌的厚壁休眠孢子主要被用于不利条件下的生存需要。


真菌孢子易扩散性
真菌孢子可以是单细胞的,也可以是多细胞的,通过真菌复杂的生命周期发展成许多不同的阶段。例如,对于丝状真菌,其生长过程是通过产生菌丝(管状分枝),在菌丝的多个方向上同步展开(称为菌丝体)。一些菌丝分支生长到空气中,孢子在这些空中分支上形成。
真菌的孢子可以传播很远的距离。重要的是,真菌的孢子不同于细菌的孢子。细菌孢子是静态的,除非物理迁移;而真菌孢子可以随着气流进行长距离传播,这取决于真菌的类型(如孢子大小等)和当时的情况。
这意味着,对于洁净室这样的封闭空间,真菌孢子很容易散布的到处都是。


真菌孢子在洁净室中生存
洁净室环境并不一定能够为真菌孢子的生存和复苏提供理想的环境条件。干燥、结构合理且定期消杀的洁净室并不适合真菌孢子生存。由于孢子是作为真菌生存机制的一部分而产生的,如厚壁孢子,这些厚壁孢子能够更好的适应不利的环境条件(如炎热和干燥的环境条件、缺乏营养、渗透压的变化以及不利的pH值和化学物质等)。这种真菌孢子是厚壁、深色、球形、微小的生物颗粒,因此能够在洁净室等环境中生存。
在进入洁净室的所有类型的真菌孢子中,当条件有利时,一部分真菌孢子复苏或者存活,尤其是在结构不合理或者潮湿的洁净室中。例如,乙烯基塑料下面存在水,将可能导致真菌的生长繁殖。
研究表明,真菌在有水的地方可以更好的生长,存活更长的时间(当然,没有证据表明真菌能在气流中生长,或者可以利用气流促进生长)。真菌的存在和灰尘也有关联;当水和灰尘颗粒存在时,真菌存活率提高。当真菌沉降到表面时,这些环境因素加上真菌孢子就成了洁净室中的一个特殊问题。
真菌孢子是否存活,这将取决于洁净室的一系列特定条件以及洁净室所在的地理位置。在生物地理学模型中,这些受到自然选择、群落分布、群落迁移和物种形成的影响。另一个因素是真菌种类,影响生存的一般因素有:温度、水和水活度、有机物浓度、氢离子浓度、无机物浓度、空气中粒子浓度、氧化还原电位、气压、光强度、地理位置和栖息地。



环境监测要点
评估药品洁净室中的真菌情况的前提是环境监测程序能够持续的检测真菌,并且能够反映所在环境的典型情况。此外,监测数据应满足进行趋势分析的需求。在检测方面,需要考虑培养基(涉及用于采集细菌和真菌的通用琼脂平板,或特定的真菌培养基)和培养条件。这些重要的考虑因素应在环境监测计划中详细说明。
进一步的考虑是方法的选择,依靠空气监测和表面监测的双重监测方法很重要。大多数的洁净室真菌源于气生菌群,在合适的条件下或可沉降到表面(如重力作用或者气流冲击物体)。
此外,真菌也可以通过物品和人携带进入洁净室。有机物和水可以促进真菌的生长,这对真菌在表面的复苏很重要。尽管没有科学证据表明真菌能在空气生长中,但气流是传播孢子的有效媒介,开放加工环节的风险监测应侧重于对气流的监测。


制药环境的真菌污染来源
制药生产环境内存在着多个可能导致真菌污染来源。在某种程度上,这取决于生产操作的类型、环境控制的执行情况以及清洁和消毒体系的彻底性。
在洁净环境中,真菌的来源很广泛,包括门踢脚板、袋子、培养箱、盒子、记号笔、干预设备、推车轮、天花板瓷砖、维护不善的地面等,在某些情况下,还包括高压清洗设备。房间气压不足、建筑震动、设计不合理的喷淋和灯光系统也是 洁净室真菌爆发的原因。环境的变化(例如环境温度升高),加上被带进洁净室的物品,也是真菌污染爆发的可能原因。潮湿或湿润的区域是另一个在洁净环境中可以促进真菌生长的因素。
由于真菌污染的来源多种多样,必须考虑所有可能导致污染的潜在因素,包括设施设计和维护(与暖通空调相关的环境控制系统),进入洁净室的物品,人员操作规范和适当的可用于清洁和消毒的产品。


制药生产环境中的潜在真菌污染来源(鱼骨图)




对任何污染事件的评估都应该通过调查和根本原因分析来解决,有不同的技巧可以用于此类调查。为了更好的完成调查,正确的定义和描述事件或问题很重要(问“五个为什么”这个技巧在这里很有用)。随后,应确定从正常情况到关注点的时间线。风险工具如故障模式和影响分析(FEMA)和危害分析与关键点控制(HACCP)等通常是有效的,使用“是/不是”表和矛盾矩阵等方法收集信息并找出疑问,这些方法有助于区分根本原因和影响因素。这些方法是有助于呈现问题的预测方法。




接下来要更详细的探讨一些需要考虑的更常见区域和需要采取的行动。


真菌与建筑环境的关系
尽管真菌通常在洁净室不会大量存在,但洁净室的墙壁上可能存在真菌,真菌将会对通风系统构成挑战,这些区域的缺陷可能导致真菌进入。这一点很重要,因为在任何建筑中,几乎没有发现天然存在于室内的真菌,大多数在室内发现的真菌都来自于外部环境,它们通过某种机制被带入室内环境。因此,当外部群落发生变化时,室内浮游真菌群落也会发生变化。
这里有两种主要类型的缺陷未经过滤的空气进入,比如通过有故障通风系统;随着水流进入,如管道泄漏。气流和水流都可以在相当大的范围内传播真菌孢子。
在这两类缺陷中,与空气有关的纠正措施更容易实现,前提是执行强有力的清洁和消毒措施(使用合适的杀孢子剂)。而漏水可能是由于损坏的设施结构导致,尤其是密封设备和乙烯基塑料。这种情况下,清洁和消杀活动可能会加剧真菌孢子的传播。
此外,如果水在乙烯基塑料下面流动,有可能导致真菌孢子的大范围传播。在这种情况下,水的持续存在将导致扩散的增加。尤其是水和水汽凝结可能导致大范围的枝孢霉属(Cladosporium)孢子污染。
除了产品污染风险外,大多数环境相关的真菌也会给操作者带来健康风险。例如,真菌毒素、微生物挥发性有机物、释放到室内的微粒都有可能成为过敏原


生产环境的现状
生产环境的现状与管道破损情况和企业通过有效的清洁和消毒程序应对事故的反应能力有关(因为损坏的表面更难清洁和消毒)。发生这种情况的可能性取决于对特定设施的维护情况,虽然随着设施的老化,良好的维护变的更加困难(在制药领域,一般超过25年的设施可能被定义为老化)。

此外,与水和温度一样,对真菌的影响因素还包括室内的高湿度及有限的通风。较高的通风率降低了真菌的持留,同时需要考虑给予建筑组件温湿性能。


生产设备的保养
维护不善的设备也可能是真菌来源之一,修复破损设备也应该成为设施真菌防御策略的一部分。例如,过滤器磨损或损坏,可能造成设施空气泄漏。
另外一个关注点是后续维护活动,例如打开机器上的面板,设备的内部区域,特别是那些通常不会暴露在洁净室环境中的区域,可能是污染源


生产人员
生产人员通常应受过良好的培训,但可能出现与个人卫生有关的问题(与进入设施有关,如在第一换衣区脱掉室外衣服和洗手)。真菌的水平和人体皮肤的固有微生物群落有关。人员会通过带入土壤引入污染,特别在鞋子上。更换受控的鞋子进入洁净室区域是一件特别重要的事情(加上穿防潮的洁净室袜子),同时穿着合适的洁净室服装、手套和口罩。其他人员变量主要与清洁和消毒的有效性有关,特别是当采用临时工(合同工)进行这类活动时。这些人员活动行为应当通过培训加以规范。


特定真菌的检测
对真菌的鉴定有时候可以提供关于其来源的线索,源于空气、建筑环境和水等。这使得鉴定变得很重要,无论是通过视觉手段鉴定还是通过微生物鉴定系统。虽然世界上只有一小部分真菌种类被描绘出来,但是通过鉴定,我们发现那些可能在洁净生产环境中被发现的真菌也属于一个狭小的类群。
鉴定的方法包括对培养基上生长的菌落进行形态观察,与手册进行对比;表型鉴定系统;基因型方法,如检测大核糖体亚基(LSU)的D1/D2区域或者内部转录间隔区(ITS1/ITS2)。



小编:常见洁净室真菌:

常见环境真菌——青霉属和曲霉属

建筑和潮湿环境——芽枝霉属

人源——曲霉属、青霉属、Trychophyton(毛癣菌属)

当然,鉴于许多真菌的普遍存在性,这些结论并不是确凿无疑的。对洁净室微生物菌群的定期回顾可以为任何分离到的真菌在常规的环境微生物菌落中的占比高低提供线索。这类回顾对于消毒剂的效果验证实验也非常重要。




纠正措施

大体上有两种纠正措施:第一是发现问题的根源并加以纠正;第二是修复问题区域,包括进行维修和运行有效的清洁和消毒制度。后者涉及到最佳消毒剂类型的选择-其中一种是杀孢子剂,并已证明其对清除(设备/环境)表面真菌孢子的效果。

在对问题响应的方面,一个常见的问题的潮湿区域或者因漏水而受损的区域。洁净室人员应迅速对设施内的漏水情况作出反应,尽快修复或者更换损坏的墙壁和天花板。

真菌孢子对许多化学物质都有抗性。真菌细胞可能对一种或多种常用的杀菌剂具有通透性屏障的固有能力。理论上,真菌孢子比细菌内生孢子更容易杀死,然而实际上并非总是如此。有些真菌能分泌酶,干扰特定的消毒剂并使其失活。此外,如果一个区域有真菌存在,那么真菌孢子通常比细菌多得多,因而对清洁和消杀的挑战更大。为了克服这个问题,必须要进行多轮清洁和消毒。

清洁和消毒的关键:

a) 使用有效的清洁剂。在有泥土、灰尘、碎片等地方,消毒剂的渗透性较差(比如像洁净室中石膏面板掉落的情况),在使用消毒剂之前,需要先进行有效的清洁。

b) 使用一种以上的消毒剂是明智的。

c) 选用的消毒剂必须具抗一系列真菌的能力。消灭孢子(细菌和真菌)通常更需要不同的接触时间,而不是标准消毒周期。

d) 为了杀死孢子,包括细菌和真菌,需要使用杀孢子剂。除了杀死孢子外,杀孢子剂还可以杀死所有的营养细胞。

e) 消毒剂需要在规定的接触时间内,在有效的温度范围内使用。反复擦拭,可以提高消毒剂的效果。

合适的消毒剂类型包括含氯类或者过氧乙酸类,或过氧化氢,或过氧乙酸和过氧化氢的混合物。在消毒剂能够达到有机体并有足够接触时间的情况下,目前没有已知的因素表明,洁净环境表面的普通真菌能够抵抗消毒剂。

影响消毒剂对真菌(以及对细菌内孢子)的有效性的一些因素有:

a) 该药剂的固有生物杀灭活性;

b) 消毒剂的浓度;

c) 接触时间。接触时间可能会因为洁净室的不同而有所不同。一些高气流的洁净室的换气效率比其他洁净室快,这可能导致杀孢子剂干燥得更快。由于干燥速度更快,可能需要重新涂抹。

d) 待消毒表面的性质。在不同的表面,消毒剂效果存在差异。此外,随着表面老化(形成隆起等),微生物可以黏附的更深,消毒剂可能无法有效渗透。

e) 表面的清洁度。杀孢子剂在有污垢的地方渗透能力特别差。

f) 应用方法。杀孢子剂应用于表面的方法需要明确定义。在几乎所有情况下,喷洒和擦拭比仅仅简单的喷洒更有效。

g) 表面的物化性质。(可能影响微生物表面粘附)

h) 用来稀释消毒剂的水的硬度。

i) 微生物种类和数量(微生物越多,种群越难杀死)。

j) 温度。大多数杀孢子剂在低温下效果很差,比如在寒冷的房间里。

k) 稳定性。一个影响因素,关系到消毒剂被制备好后是否稳定。

通过对生产环境的微生物群落的评估来进行消毒剂效果的评价是一个好方法。




预防措施

作为纠正措施的延伸,对真菌污染更进一步的预防措施是对洁净室进行良好的设计。例如,这里的设备应具有足够的空调控制系统,例如ISO 14644 9级(欧盟GMP D级,实施中)区域的换气率至少是每小时15次,以及ISO 14644 8级(欧盟GMP C级,实施中)区域换气率每小时20次。同时,还需要考虑空气分配,以确保洁净室的所有区域都能获得新鲜和适当调节的空气,因为室内机械通风对建筑物内的微生物群落有重大影响。

此外,在生产环境中使用的织物应采用不吸水或不促进真菌生长的无孔材料。为了增加进一步的保护,可以使用一些抗真菌涂料和油漆。空调控制系统的另一方面是提供合适的温度和湿度控制,避免可能促进真菌生长的极端情况。其他设计因素包括确保设计的表面便于接近,并且表面易于清洁和消毒。



药品微生物检测人员面临的问题
尽管洁净生产环境中的真菌存在与药品召回之间的联系是明确的,但是制药企业面临的任务并不简单。这在一定程度上是由于缺乏真菌检测和鉴定等方面的经验:
据Cundell称,制药企业面临的共同问题包括:
1、在环境监测过程中对真菌的分离和趋势的关注可能不够;
2、消杀剂有效性验证可能并不能充分说明针对真菌孢子的消杀活性;
3、在产品或环境监测中发现的真菌很难被计数。许多采集到的真菌是丝状的,有带孢子孢子的气生菌丝。这种生长方式会使得以菌落方式评估真菌水平的适用性受到质疑。
4、在渗水可能促进真菌在制药设施中生长缺乏足够的认识;
5、大多数的药物微生物实验室缺乏可靠的,鉴别真菌属,特别是真菌种的能力。
需要充分注意上面的每一个问题才有助于解决洁净室中的真菌带来的问题


总   结

对洁净室的风险可能会导致终端产品的污染,这已有案例。
对于无菌产品在终端产品中检测到真菌构成重大风险,并将触发整个批次召回。对于非无菌产品如果在终产品测试中检测到真菌,则需要评估该真菌是否是“不可接受”的。根据Sutton博士(2006)的说法,该风险分析至少应该包含四个独立的考虑因素。分别是:所见微生物的绝对数量,微生物的特性,产品特性和对患者的潜在影响。
这意味着评估洁净室中的真菌群落成为环境监测计划的重要组成部分,通过空气采样和表面采样。洁净室真菌起源于室外,真菌物质在室外的迁移情况足以解释所观察到的室内真菌在空气中的分布。
通过对气流的评估来确定真菌污染扩散的难易程度是必要的;对表面的评估,特别是在有机材料和水存在的地方,表明真菌存活和生长的可能性。
因此需要制定监测方法、制备平皿和培养。另一个问题是真菌的溯源、趋势分析和鉴定,因为制药企业的微生物实验室中往往缺乏有丰富经验的真菌专家。这可能导致低估真菌和产品污染事件之间的关联,并影响对洁净室和受控环境的评估。
一旦真菌被大量发现,就需要采取措施消灭真菌种群。这通常与消除水源、修复损坏和有效消毒有关。这些措施需要迅速采取,以尽量减少真菌繁殖和扩散的几率。还需要改进洁净室的设计,以帮助最大限度地减少真菌进入洁净室的可能性,并降低真菌留在受控环境的可能性。

原文:Investigating and Addressing Fungal Contamination in Pharmaceutical Cleanrooms By Tim Sandle Mar 23, 2018 6:05 am PDT


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