浙江省微生物研究所
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微生物鉴定通常应用于筛查产品中的有害生物、分析环境微生物菌群以及超限事件的溯源分析，是微生物学职能的重要组成部分。每个微生物实验室都应该开发特定的鉴定策略，包括鉴定对象、鉴定时间、鉴定水平以及鉴定方法。制药微生物学的很多内容均被列在监管机构发布的指导文件或者纲要中，包括对中间产品和成品的生物负载评估的重要性，以及使用规范方法监测环境的必要性，但是有关微生物的鉴定尚未明确。基于微生物表型或基因型的鉴定方法已经建立，方法的选择取决于鉴定的内容，需要仔细分析以确定鉴定什么类型的样品，哪种鉴定水平是合适的（形态学、属或种），以及如何利用已收集的信息。另一个决策点在于鉴定是在实验室内部进行，还是外包出去。本文对以上这些要点进行了阐述，并为每个制药或医疗组织的微生物学家提供了开发微生物鉴定策略的基础。
微生物鉴定可以被定义为“通过预先选择并适合于所研究问题的有限范围的测试进行微生物表征”。有一系列的技术可以用于微生物鉴定，可追溯到Christian Gram的开创性差异细胞壁染色，并扩展到最近的分子生物学技术。微生物鉴定的目的是将一种微生物分离株与另外一种分离株区分开来，并将该分离株归类于科（属）和种（这是在表型鉴定可以达到的最佳水平），甚至是特定的菌株（通过基因型鉴定；菌株是微生物的遗传变异体或亚型）。鉴定可以被认为是推定的（给出可能的属的指示）或确认的（指定到种水平的情况下）。确认的鉴定结果最常用种名称表示（例如，Pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞杆菌）。种名通常包括两部分——属名（Pseudomonas）和种名（aeruginosa）。同样以假单胞菌为例，有时候种无法确定，鉴定结果为"Pseudomonas species"，缩写为“Pseudomonas sp.”。（通常情况下，"sp."用于单数，"spp."用于复数。）商业化的微生物鉴定系统可以分为表型和基因型两大类，此外，蛋白质组学有时也会单独划分为一类，但是也有些文章认为蛋白质会受外界环境的影响，会把其归为表型一类。基因型和表型的区别在于遗传上（遗传信息）。“基因型”是指生物的全部遗传物质（基因）组成，不论表达与否；“表型”是指生物体个别或少数性状以至全部性状的表现，例如形态、发育或者行为。在不同的环境下，表型会随着环境条件发生改变。例如，微生物菌落在两种培养基上会呈现不同的颜色，具体的表型变化如表1：
对于许多实验室来说，表型方法的成本相对较低，应用最为普遍。微生物的表型包括细胞的大小和形状、细胞组成、抗原性、生化活动以及对抗菌剂等的敏感性，通常取决于所使用的培养基和生长条件。此外，表型反应通常包括对不同化学物质或不同生化标志物的反应。表型方法基于相对较少的观察和测试能够鉴定到属或种水平，这些方法主要依赖于微生物的培养并且要从单菌落的纯培养物开始。传统的生理生化鉴定实验操作复杂，往往还会出现人为误差，影响鉴定结果的重复性和再现性，自动化设备的出现改善了这一状况。表型鉴定方法一般从染色开始，如革兰氏染色、真菌或细菌内生孢子的特定染色。在比较鉴定和差异的最终结果时，革兰氏染色的结果可以帮助研究者进行有效地错误排查。此外，其他有用的信息源自肉眼可见的菌落形态，例如菌落形成和色素沉着。标准菌落外观的描述可以作为鉴定的有效补充，例如菌落轮廓、表面外观、气味、菌落高度、半透明度和颜色。补充测试同样可以辅助鉴定，其可用于代替或支持自动化方法（有些是自动鉴定测试系统的组成部分），补充测试的结果可以帮助评估鉴定是否有效。表型方法主要的补充测试列举如下： 该试验用于鉴定具有过氧化氢酶的细菌，此类细菌能催化过氧化氢的分解并伴随着氧气的释放，继而出现气泡。过氧化氢酶试验通常用于区别葡萄球菌（Staphylococci）, 微球菌（Micrococci）和 链球菌（Streptococci）。它还可以用作补充测试，以区分不能合成过氧化氢酶的严格厌氧细菌。该试验旨在检测是否存在细胞色素电子传递系统相关的氧化酶。具有氧化酶的细菌，首先氧化细胞色素C，再由氧化型细胞色素C氧化对苯二胺，生成有色的醌类化合物。该试验用于从葡萄球菌属中区分金黄色葡萄球菌和其他菌种，例如中间葡萄球菌（Staphylococcus intermedius）。诊断试剂盒通过测试不同微生物凝集特殊涂层乳胶颗粒的能力，判断待测菌种是否具有凝固酶/A蛋白（一种热稳定肠毒素）以达到区分的目的。溶葡萄球菌素是一种通过细胞裂解可以区分葡萄球菌和微球菌的酶，与未被裂解的微球菌相比，葡萄球菌属细胞壁被裂解，细菌悬液浊度下降或变清。一些杆状细菌可以通过鞭毛进行运动，运动性测试可以利用显微镜或者宏观方法（借助特殊的培养基）来观察不同微生物的形态，以确定它们是否运动。微观方法还可以区分真正运动的细菌和布朗运动的细菌。氧化-发酵（Oxidative-Fermentative）该试验使用以葡萄糖为碳源并含有pH指示剂的专门培养基，随着葡萄糖发酵，pH降低并且发生颜色变化，能够将细菌分为有氧（氧化）代谢、无氧（发酵）葡萄糖或两种代谢方式都具备的细菌。该测试主要用于鉴定革兰氏阴性细菌。特殊培养基用来培养和区分不同的微生物群。有许多类型的选择性培养基可用，例如MacConkey琼脂培养基，它含有胆汁盐和乳糖，促进肠道细菌的生长，抑制非肠道细菌的生长。c）兼性厌氧菌或好氧菌-在有氧或无氧环境下均能生长，在一种状态下生长状况良好，另外一种状态下也可以维持生存必要时，可以作为鉴定或培养过程的一部分，使用专门的气罐进行评估。各类细菌对温度的要求不同，在制药环境中分离的许多微生物是嗜温的（生长范围在20-40°C）。其他的微生物具有特殊的温度要求，例如嗜热菌、嗜冷菌等。溶血是指由某些细菌毒素裂解红细胞，血红蛋白逸出，其主要有两种：一种传代培养在血琼脂上时在菌落周围产生大而清晰的光晕，这是由称为溶血素的细菌毒素引起的（β-溶血）；另外一种产生琼脂的绿化或褐变，是由镁离子的缺失和琼脂的变色引起的（α-溶血）。该试验主要用来区分葡萄球菌属（Staphylococci）和链球菌属（Streptococci）。生化检测方法成本低，是最为常见也是最经典的检测系统，其中研究细胞的酶活性是鉴定细菌的强有力试验。许多生化测试的基础是细菌能够使用不同的碳源来获得维持生命所需的能量，例如，BBL-Crystal system自动微生物鉴定系统或API鉴定系统。很多实验室现在采用半自动化表型鉴定系统，例如VITEK（含有多种生化反应孔的检测卡）或者OmniLog（利用微孔鉴定板的小型化系统）。这种表型方法是通过排除法工作的，如果测试中A是阳性而B 为阴性，则选择一组可能的微生物，而排除另外一组，随后测试C和D，以此类推。该测试结果将会与基于二叉式检索表的数据库进行比对。另一种方法是使用气相色谱分析细胞脂肪酸，其中脂肪酸酯的模式通过气相色谱法测定。通过气相色谱（GC-FAME）进行的脂肪酸甲酯分析在环境和临床微生物的鉴定中已经应用多年，但是在制药环境微生物领域应用并不常见。另外，近年来，流式细胞计数和基于蛋白质图谱的MALDI-TOF技术也被应用微生物的鉴定。
基因型方法具有不同类型微生物的数据库，其不依赖于微生物的分离培养基或生长特征。基因型方法开辟了一整套新的种和亚种，并对亲缘关系相近的种进行再分类，通过表型相似性聚集在一起的分类单元很可能是多系群（polyphyletic groups）。基因型方法包括杂交和测序（最常见的是16S rRNA）。通过分析DNA-DNA同源性或来自不同细菌的两条DNA结合（杂交）的程度如何，以确定两种微生物的亲缘关系。选择测序检测基因组中16S rRNA区域的方法的原因是：2）它高度保守，随着时间的推移，16S rRNA基因的功能没有改变，表明随机序列的变化是对进化时间更准确的衡量标准；3）16S rRNA基因足够大，可用于信息学分析。对于丝状真菌的鉴定，可能需要更昂贵的方法，例如，基于PCR的内部转录间隔区（ITS）的测序。一些更新的技术也取得了进展，例如用于真菌感染检测的β-D-葡聚糖检测，（1-3）-β-D-葡聚糖占真菌细胞壁成分的50%以上，是真菌细胞壁的特有成分，其可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固；Riobprinter是一种全自动微生物基因指纹鉴定系统，以微生物独特的基因组为基础，可自动化同步完成菌株水平的鉴定和分子分型 。另外一种快速方法是聚合酶链式反应（PCR）系统，PCR技术使用DNA聚合酶扩增特定的DNA片段，通过扩增“细菌条形码”形式的基因序列，利用凝胶电泳分离并可视化以产生对该菌株特异的“条形码”。通过比较测试，可以定量地检测不同生物之间DNA序列的差异，从而构建系统发育树以说明生物之间可能的进化相关性。微生物学实验室需要决定是否进行基本检测（如差异染色）、表型检测或基因型检测，这通常取决于：药品生产者需要综合考虑以上因素并决定鉴定在实验室内部进行或者外包给其他实验室。对于内部鉴定，如果每个月有20-30个鉴定，出于成本效益的考虑，通常会选择半自动化方法。由于成本和复杂性，很少有实验室在内部进行基因型检测，但是当需要这种鉴定时（例如，调查无菌试验失败），基因型检测可以考虑选择合适的供应商。
微生物鉴定方法在引入实验室之前的验证是非常有必要的。例如通常要包括代表性的参考微生物进行验证，人员的重复性以及不同实验室之间的比较。使用自动化系统降低了进行微生物鉴定所需的技能水平，但是有经验的微生物学家对结果的解释仍然很重要。一个常见的监管问题是数据审查不够充分，未能对非典型的鉴定结果提出质疑。环境里回复到炭疽芽孢杆菌时（与蜡样芽孢杆菌非常接近），制药微生物学实验室应该对这一结果提出质疑。分离到无害的生物也是如此：如果复原的生物体通常与热带昆虫有关，那么需要考虑实验室是否真的有可能回复到它？这种情况下应该启动重新鉴定。如果初始筛选操作不正确，例如革兰氏染色、鉴定试剂盒或者卡片的错误使用、过度依赖于一个单一的鉴定系统，都有可能会发生这样的问题。建立适当的区分水平是鉴定策略的重要考虑因素，这有助于微生物工作人员决定该鉴定哪些样品以及可以如何使用数据。审查结果应采取议定程序的形式，以便在实验室内建立一致的程序。如果在GMP检查期间提出问题，书面的议定程序提供了与监管机构讨论的途径。鉴定方法的选取基于微生物学家的需求。在某些情况下，知道微生物是革兰氏阳性菌就足够了。在其他情况下，微生物学家可以通过表型鉴定来了解微生物的一般情况，评估生物是否有害（不可接受）或者表示失控。在特定的情况下，例如无菌试验失败或者在无菌灌装实验和操作者之间获得明确联系的情况下，可能需要通过分子手段找到无菌试验污染物和洁净室生物之间的联系。在对微生物偏离的研究中，了解微生物的类型可以提供关于其来源的宝贵信息。例如，许多革兰氏阳性球菌是人体皮肤菌群的一部分。革兰氏阳性杆菌可以通过设备和鞋类转移到洁净区域，革兰氏阴性杆菌通常与水源相关。收集这些数据可以提供以下帮助：b)帮助进行产品安全风险评估，例如非无菌产品的潜在污染，与无菌加工区内的侵入有关的污染；然而，需要鉴定的水平（例如镜检、属或种）将根据所测位置或产品的关键程度而变化。此时，不一定都需要鉴定到种水平。例如，对于从低风险区域（例如未分类的房间和饮用水）采集的样本，可以采用简单的形态描述和革兰氏染色。以下情况需要到属或种水平的更详细的鉴定：较高风险的分离株（例如来自于原料或成品的分离株）；超过行动限（定义为可能造成危害的阈值）；来自于高等级洁净室的分离株（例如所有无菌灌装分离株）。通过对生物体进行简单分组，可以获得非常宝贵的信息，如下表2：
对于非无菌药物，在审查环境监测时，通常不需要基于代谢反应的表型鉴定之外的鉴定水平。然而，无菌产品制造商的高等级洁净室则需要更高的鉴定水平，可以对关键样品进行基因型鉴定，例如无菌测试失败或来自过程模拟试验的阳性容器。此外，在进行无菌灌装的限度调查时，可以通过对不同分离株进行表征以确定它们是否相关。因此，鉴定水平依赖于区域（无菌或者非无菌生产）和样本类型。尽管没有“通用方法”，但是一些重要的场景下可能需要着重考虑：制药用水系统：低于警戒线时可以定期进行微生物鉴定以建立典型的污染特征。超过警戒线时候尤其要注意，如果是革兰氏阴性，表示存在与水有关的污染，当相关计数构成上升趋势的一部分时，进行物种鉴定。达到或者超过行动限时，由于生物可能是通过外部环境污染而产生的，例如由于管理不善导致的出口管道的污染；或者是由如取样和试验过程中无菌技术操作不当引起。革兰氏阳性菌的鉴定结果提供的信息有限。应对所有革兰氏阴性菌进行种水平鉴定，判断其是否为有害生物，这些信息对于用于配制非无菌产品的水尤为重要。无菌生产：鉴于大多数设施采用1 CFU作为行动级别，“低于警告和行动级别”不适用于A级区域。B级区“低于警告和行动级别”，但是A级区检测到污染并且需要进行比较，B级区分离到的样品进行鉴定是十分必要的。A级区域超过行动限时，必须进行微生物鉴定，分子手段是首选，并需要对关联环境分离到的微生生物样本进行充分鉴定和比较，分析污染的关联性。无菌检验：包括从测试环境和无菌灌装过程中回收的任何微生物都应进行物种鉴定。非无菌产品：超过阈值，对有害生物进行初步筛查是非常有必要的。并非所有非无菌产品都类似，因为风险取决于水活度等关键因素。当水活度低于大多数微生物不能生长的点（例如Aw＜0.6）时，风险相对较低；但当Aw≥0.8时，鉴定的重要性和对准确性要求增加（这取决于产品特定的风险评估）。对于0.9及以上的水分活度，建议对所有高频的微生物进行鉴定。通常情况下，对从指定系统中收集的微生物群落进行定期回顾是个很好的做法。对这些收集的数据进行趋势分析并研究非典型模式，了解不同微生物的潜在来源也有助于调查微生物的偏差，并有可能发现：a）可能的污染源。例如，许多革兰氏阳性球菌是人类皮肤菌群的一部分，革兰氏阳性杆菌可以通过设备和鞋类转移到洁净区域，革兰氏阴性杆菌通常与水源相关。这些特征对于许多根源分析是很重要的，例如，将污染从表面和中间产品关联，确定是否可能由人员干预引起污染，或推断无菌测试失败是由于产品污染还是假阳性。b）鉴定还可以辅助筛查不可接受微生物。微生物对产品质量属性的影响将取决于产品的预期或潜在应用，生产方法以及后续处理。通过鉴定获得的信息可用于与产品配方进行对照发现潜在的问题。如果微生物有可能降解产品，降低其稳定性，那它也是不可接受的。以下一些因素可以用来评估微生物在该过程中存活的可能性（这些因素首先由Halls提出并由Sutton进一步发展形成清单，该清单并非详尽无遗，微生物学家们都应制定自己的风险评估标准）:同样地，这样的信息一定程度的反映了污染微生物存活或者繁殖的可能性。例如在以下条件下，微生物生存率通常较低：但是，上述列表中的因素还取决于微生物物种。第二个清单上的不利条件也可能会对于某些特定的微生物来说，是生长或存活的最佳条件。c）此外，监测微生物趋势的变化可以指示清洁区域环境中可能出现的问题，例如清洁和消毒标准的降低，可能与操作员技术或消毒剂制备有关；产芽孢细菌的增加可能表明选择消毒剂或其应用方式存在问题。d） 关于上述问题，推荐定期用设备分离株测试消毒剂。分析最常见的微生物类型或在评估风险时可能对消毒剂的挑战更大。e）选择用于生长促进测试的微生物。监管期望是用于促进生长测试微生物培养基的测试组中包含环境分离株（或“野生型”）。许多公司将选择两到四种微生物，并将其添加到药典推荐的培养基列表中。在设定频率下，根据微生物群落概貌，在必要时对这些生物进行审查和替换。本文概述了微生物鉴定策略的基础以及一些可采用的不同类型的微生物鉴定技术。鉴定技术包括表型和基因型方法。对于任何微生物鉴定系统，尤其是在对系统发育和表型系统进行比较时，通常是基于不同方法和不同数据库相结合的结果。因此，一些微生物学家认为，正确表征微生物的唯一方法是通过“多相方法”-多种方法相结合，例如将表型法和基因型方法相结合。无论选择哪种鉴定方法，实验室都必须具有使用该系统的能力，与已知微生物的鉴定保持一致，包括本地分离株，以确保在常规分析中进行的任何鉴定都是有效的。对分析研究人员而言，应该通过鉴定已知的本地微生物群落和参考微生物来进行日常验证。外包鉴定时，应当包括适当的技术协议和质量职能部门批准的设施，还应当考虑授权问题。在概述微生物鉴定策略时，本文提供了许多关于鉴定水平的建议，目的是提供一个框架，不同的组织可以从中构建自己的模式。在制定方法时，重要的是考虑以下问题：鉴定的目的是什么？微生物工作者要了解什么？微生物工作者从结果中能获得什么信息？这些问题有助于选择合适的微生物鉴定试验并制定鉴定准则。
