【年度报告】制药企业环境微生物数据分析及解读-浙江天科高新技术发展有限公司

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前言

近年来，越来越多的法规、文献，甚至是FDA的警告信中，都不断提及在无菌检验方法验证、清洁和消毒剂效能验证、无菌工艺验证等各种微生物相关的验证中，除了使用标准菌株以外，也应当使用企业自身环境中分离到的具有代表性的微生物进行相关的验证实验。

那么，哪些菌才具有代表性呢？

这就需要企业对环境监测中分离到的微生物进行属和种水平的鉴定（在超限时对采集到的微生物进行鉴定，以及在未超限时进行周期性的环境微生物鉴定），并且对鉴定结果进行评估，以确定常见的微生物类型，然后根据微生物的种类特征和数量从中筛选，进行相关验证实验。

当然，环境微生物数据库建立的意义不止于此，数据库的建立有助于企业了解药品生产过程中微生物的负载情况，对于建立有效的生产过程微生物污染溯源分析体系具有极其重要的现实意义。

环境菌库的应用

我们（浙江省微生物研究所）对2017-2018年积累的环境微生物数据进行了统计和分析，样本采样点绝大部分为相关企业洁净区或其他受控环境，涵盖制药、食品、化妆品等行业，其中以制药企业为主。基于保密原因，我们并不要求企业提供详细采样地点，但通过对历史数据的分析，我们仍然发现了一些有意思的东西，与大家分享。

细菌真菌检测比例变化趋势

2018年全年真菌月度平均检出率为11.4%，这一数值高于随机抽取的10家环境微生物数据库建设情况较好的制药企业的真菌检出率（3%-6%）。对此，我们并不意外，相比于细菌多种多样的鉴定手段，真菌的鉴定手段就显得匮乏一些。因此，企业在分离到真菌时，更倾向于委托给我们鉴定。

菌群相关性分析

我们对两年来鉴定到种或属水平的菌种（细菌鉴定率为98.88%，真菌鉴定率为96.89%）进行了聚类分析。众所周知，环境中的微生物并非独立存在，各个微生物种属直接存在着复杂的互作关系。

企业在环境监测中采集到的微生物主要体现为两类关系：一类是Win-Win的互惠关系，一类是Win-lose的抑制关系；具有互惠关系的微生物倾向于共同被检出，而相互抑制的微生物则可能呈现出相反的变化趋势。

洁净环境中检出的微生物大致可以分为3类：

①与人员携带相关：如葡萄球菌属（Staphylococcus）、微球菌属（Micrococcus）、短杆菌属（Brevibacterium）、莫拉氏菌属（Moraxella）、考克氏菌属（Kocuria）、皮肤球菌属（Kytococcus）等，生境主要与人体相关，在这些菌属的检出率上也反映出了一定的正相关性；

②与水系统相关：如罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、微杆菌属（Microbacterium）、污泥单胞菌属（Pelomonas）等生境主要为水体，常可在水系统中以形成生物膜的积聚，到一定规模时可能造成管道堵塞。

③与土壤相关：如芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus），这些菌属都具有较强的抗消杀能力，可能为该洁净室的土著菌属，也可能由物料、设备包装等因素携带进入洁净环境。

从上图，我们不难看出，不同种属的微生物之间，以某种方式联系在一起。例如，可能为同一来源的微生物具有共同检出的倾向。而定殖菌之间可能存在互惠互利的现象，从而实现在洁净室环境的持留。

优势菌种对比

我们对比了2017-2018年检出率超过1%的菌种，发现两年优势菌属和菌种均十分相似。这表明尽管地域、气候等因素对菌群结构存在一定的影响，但遵循GMP体系的受控生产环境总体是具有较高的相似性，因此环境中的优势菌构成也存在着一定的相似性。

这也表明，在持续受控的环境中，菌群结构应当是具有稳定性的。研究各个企业、各个时间这种稳定结构的变化可能有助于我们对环境微生物管控水平进行更精确，更数据化的评估。

未知菌属的分类和溯源

无论采用何种的鉴定方法，能否鉴定到种或属，其实都取决于该方法所依托的背景数据库的大小。然而无论多大的数据库均有其局限性，一旦分离到的菌未被背景数据库收录，我们就无法获得其种属信息。但是，采用基因序列方法进行微生物鉴定的优势在于，即使我们无法获得种属信息，我们依然可以依据其基因序列的相似性进行物种的划分。因此，我们对未鉴定到种属的细菌（1.12%）和真菌（3.11%）也从序列水平进行了分类。

未知细菌97%序列相似度聚类

未知真菌97%序列相似度聚类

从两年的数据中，我们根据基因序列的相似度，一共得到了细菌97%相似度水平集合113个，99%相似度水平集合218个，真菌97%相似度水平集合45个，99%相似度水平集合50个。

这个数量显然是小于我们实际的未知菌检出数量的，这意味着，有一些未知菌是多次被检出的（上图中色块大小代表97%相似度水平集合的检出频次）。这意味着，即便污染菌的鉴定结果是未知菌属，我们也可以通过序列相似度的比较，进行基因水平的溯源分析。

同时，如果对一些常见未知菌的特性进行进一步研究，可能有助于我们更好的管控生产环境的微生物风险。

特定菌属的回顾分析

除了数据统计以外，我们也可以利用历史数据运用统计学手段进行一些菌群动态趋势的预测。如下图

2017-2018年芽孢杆菌属（Bacillus）的总体平均检出率在13.8%左右，总体月度波动较小。对比单个企业的抽样数据，我们发现无菌药品生产企业的芽孢检出率普遍低于10%，一般在6%~8%之间，非无菌制剂和中药企业的检出率则根据管控情况不同存在较大波动，一般在15%~30%之间，不排除芽孢杆菌检出率较高的企业存在选择性送样的情况。

另外，我们可以依据趋势推测，在未来1-2个月的芽孢杆菌总体检出情况应当会保持在13-14%%左右，若实际数据与此出现较大偏离时，可能意味着有不受控情况出现。

后记

制药生产环境中发现的大多数微生物是人源的革兰氏阳性杆菌和革兰氏阳性球菌，真菌则是酵母和丝状真菌，我们的数据也体现了这一点。

同时，我们也在来源于水环境的菌中，发现了一些革兰氏阴性杆菌，它们通常具有条件致病性，如粘质沙雷菌（Serratia marcescens，又称褪色沙雷氏菌）。

如果企业的水系统中有这些菌的存在，会带来极高的终产品污染风险。

我们通过数据库调取了2017-2018年肠杆菌属、粘质沙雷菌的检出数据，发现月平均检出率分别为0.6%、0.1%，这个表明目前国内企业，对这些菌的管控非常到位。

产品中污染的微生物来自于原料，环境和人员的相互作用。因此，从原材料、环境、人员和产品中分离检测并准确鉴定其中的微生物，分析微生物的特性，和变化趋势，是实现微生物风险评估和管控的基础。通过建立环境微生物数据库，确定对应企业自身产品的“不可接受微生物”列表，才能更有效地验证生产工艺或者消杀是否能够有效控制原料或者环境来源的“不可接受微生物”，避免其最终污染产品。

后

记

后记

经过连续几年的制药环境微生物数据库建设实践，我们发现虽然相比于自然环境，洁净环境的微生物种类更少，优势菌群占比更高，菌群面临的生存胁迫更大，但洁净环境的微生态仍具有其独特的多样性和稳定性。

虽然存在地域差异、产品差异等因素，但各企业洁净环境中的优势菌群仍具有一定的相似性，且在一定程度上遵循“二八原则”，既20%的优势菌属占总检出率的80%。

这使得我们利用已知环境微生物数据来评价环境微生物数据库建设情况，通过优势菌群的变化来指导微生物管控计划，通过数据库来比较不同企业间的微生物管控水平成为可能。

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