DOI：10.1038/s41587-019-0156-5

Published：2019.06.24

IF：45.117

      现状：LRIs在2016年造成全球至少300万人死亡，它们可以细分为社区获得性肺炎(CAP)、医院获得性肺炎(HAP)、支气管炎、细支气管炎和气管炎。发病率和死亡率取决于感染部位、病原体和宿主因素。在英国，CAP导致每年约29,000人死亡；在美国，HAP导致每年约36,000人死亡。最常见的细菌性CAP病原体是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，最常见的HAP病原体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肠杆菌科 (Enterobacterlaceae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。然而，多种细菌和病毒病原体可引起LRI，这使得诊断和治疗成为一项挑战。

      应对这种挑战，宏基因组测序具有得天独厚的优势，相比于传统鉴定方法，其具有周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势，而且宏基因组测序克服了很多不能培养的微生物的弊端，被越来越多地应用于微生物鉴定中，特别是未知病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法，包括二代和三代测序。相较于二代测序鉴定存在从样本到结果的周期较长，测序读长短等问题，三代测序(如Nanopore测序)具有快速文库制备和实时数据采集的优势。

      利用抗生素治疗：严重LRI的初始治疗通常包括经验性广谱抗生素。鉴于许多患者感染了易感细菌或病毒，广泛地“盲目”使用广谱抗生素是浪费，并且构成了不良的管理。抗菌治疗会破坏肠道菌群，并可能导致耐药细菌和艰难梭菌的出现。Nanopore宏基因组学可以快速准确地表征细菌LRI，减少过量使用广谱抗生素。

      病原体的识别：此外，“黄金标准”培养和药敏试验太慢，周期较长，通常为48-72小时，并且临床敏感性低。分子手段可以在几个小时内识别病原体及其抗生素耐药性，实现早期靶向治疗并支持抗生素管理。

      数据分析优势：虽然核酸扩增试验(包括PCR)是快速且高度特异性/敏感性的，但多重化存在限制，并且还不断需要更新基于PCR的方法以应对新出现的抗性基因和突变。基于宏基因组测序的方法有可能通过将速度与所有存在的微生物的全面覆盖相结合来克服培养和PCR的缺点。新一代测序平台，如Ion Torrent和Illumina，被广泛用于宏基因组测序，但它们需要在分析开始之前完成测序运行(尽管一种最近报导的LiveKraken能够在运行结束之前分析原始Illumina数据)。Nanopore具有快速文库制备和实时数据采集的优势。

      无论是二代测序还是三代测序，在大多数的临床样本中，往往存在大量宿主DNA，病原体DNA只占很少一部分，因此，得到的测序数据中只有很小的一部分能够用于物种和耐药基因的鉴定，并且从大量的原始数据中通过生信方法，过滤掉宿主序列需要大量的计算能力且耗时很长，也会影响临床样本中低丰度病原体鉴定的敏感性。

      Nanopore测序已被用于从临床样品中靶向鉴定病毒和细菌病原体，由于共生呼吸道菌群的存在以及宿主：病原体核酸的高比例(痰液中高达105:1)，呼吸道样本对宏基因组测序提出了严峻的挑战。Nanopore测序先前已用于两个没有去除宿主DNA的细菌性肺炎患者的样本，但绝大多数读数是人类来源的，只有一个和两个读数分别比对上感染的病原体-铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。通过去除宿主DNA，或许可以改善宏基因组学方法。虽然商业试剂盒和已发表的方法可用于去除宿主DNA，但是它们在复杂呼吸道样本中表现不佳，需要更好的方法。本研究提出了一种基于皂苷的Nanopore快速诊断方法，从临床呼吸道样本中去除高达99.99％的宿主核酸，并在6小时内识别病原体和抗生素抗性基因。

      呼吸道样本宏基因组学工作流程包括：宿主DNA去除、微生物DNA提取、文库制备、MinION测序和实时数据分析。

1) 方法适用性测试：

对来自40名疑似细菌LRI患者的呼吸道样本进行了试验方法的测试。

5个样本中(额外)检测到未通过常规临床微生物培养的其他病原体：P8、P14、P22、P29、P30；(红)

3个样本中未检测到使用常规临床微生物培养的病原体：P3、P37、P34。(蓝)

该方法灵敏度为91.4％，特异性为100％，灵敏度和特异性计算 Clinical Calculator 1

2) 宏基因组学优化：

两个培养阳性的痰液样品用于优化实验，一个含有金黄色葡萄球菌和一个含有铜绿假单胞杆菌。

      a. DNA 提取：引入样品预处理步骤——磁珠研磨，以优化裂解，去除第二次DNA酶处理并减少洗涤次数将宿主DNA去除方案从90分钟缩短至50分钟，而不影响效率。

      b. 文库工作：通过将文库制备PCR延伸时间从6mins减少到4mins，通过4分钟和6分钟延伸时间产生的文库之间的微生物群落谱(具有≥0.5％分类读数的生物)的比较显示，在金黄色葡萄球菌样品中，群落中的次要成员的丰度仅有微小差异，并且平均阅读长度略微减少。

优化方法：在DNA测序前，将时间周期缩短至4h以内。

3) 检测限度：

该方法的检出限为10³-10⁵CFU/ml

LoD如何计算？

使用未感染的“正常呼吸道菌群”(NRF)的痰液样品(高和低共生菌群背景各三个重复)，在已知的细胞密度下加入连续十倍稀释的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物。如果存在≥1％的分类微生物读数，则每个重复被定义为'病原体'阳性(从分析中删除了WIMP分配中q-score <20的低质量读取比对)。

在高细菌背景下，大肠杆菌的LoD(≥2/3重复阳性)被确定为100,000(10⁵) CFU/ml，金黄色葡萄球菌的为10,000(10⁴) CFU/ml。

在具有较低细菌背景的痰样品中，LoD较低(10³金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)。

4) 模拟菌群检测：

模拟群落由呼吸道样品的临床分离株包括 S. pneumoniae, K. pneumoniae, H.influenzae, S. maltophilia and P. aeruginosa组成， 还包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株(分别为H141480453和NCTC 6571)。分别培养之后，将其混入正常痰液样本中进行模拟群落分析，结果表明：基于皂苷的宿主DNA去除方法不会无意中从常见的呼吸道病原体中去除DNA，除了肺炎链球菌(平均损失5.7倍)。解释：肺炎链球菌细胞可能在宿主DNA去除过程中裂解，或者是进行模拟群体实验时可能已经生长至静止期而裂解。

5) 优化方法测试：

与培养相比，优化方法灵敏度为96.6％，特异性为41.7％。从样品到结果的时间约为6小时，包括2小时的MinION测序。

a. 在8个样品中，检测到了除培养阳性之外的病原微生物：K. pneumoniae in S5, P. aeruginosa in S7, M. catarrhalis in S14 and S39, S. pneumoniae in S8 and S15, S. aureus in S29 and S. pyogenes in S27；

b. 7个样品中，培养结果为NRF/无显著生长(NSG)，检测到多达两种潜在致病菌：H. influenzae and S. pneumoniae in S10 and S21; S. pneumoniae in S11 and S28; M. catarrhalis and H. influenzae in S12; H. influenzae in S31 and E. coli in S32；

c. 4个样品中，培养方法鉴定出两种病原微生物混合感染，使用优化的方法S9仅检到一种病原微生物，而S27、S38、S41均准确检测到两种病原微生物。

使用基于病原体特异性探针的qPCR测定了不一致的结果，其增加了灵敏度(100％)和特异性(83.3％):

      a. 通过qPCR证实了宏基因组学检测到的大多数其他病原体(19个中的12个)，这使得优化方法的特异性增加到83.3％

      b. qPCR对铜绿假单胞菌(S9)呈阴性，将灵敏度提高至100％。

最后还有7个样本结果存在不一致，其中5个样本均为流感嗜血杆菌或肺炎链球菌是阳性的。猜测：由于基于kmer的读取分类在种的水平上可能是不可靠的，特别是当一个属中的物种高度相关或具有共享基因时，这些假阳性检测很可能是由WIMP对读数的错误分类引起的，为了克服这个问题，该研究进行了所有流感嗜血杆菌和肺炎链球菌阳性样本的pathobiont特异性基因分析(siaT和ply特异性基因分别来源于相应的参考文献中，使用minimap中的long reads数据的默认参数进行比对，并通过qualimap对比对上的reads进行量化，如果样本中包含1个以上的特异基因的拷贝，那即为阳性)。该分析证实，假阳性结果(n=5)是由k-mer错误分类引起的，并且与培养+qPCR金标准相比，宏基因组学测试灵敏度和特异性为100％。

病原特异性基因分析：

6) 抗生素抗性：

为了最大化对患者管理的影响，需要鉴定临床相关的抗生素抗性基因以及感染病原体。在这方面，目前的宏基因组学方法具有潜力但仍需要改进。

利用ARMA进行抗性基因分析，数据库为CARD，共检测到的183个抗性基因：

26：培养微生物固有的基因；

24：与所观察到的表型相吻合；

4：与所观察到的表型部分吻合；

1：不太可能与所观察到的表型吻合；

14：由于临床实验室没有测试相关药物，因此无法确认任何相关的耐药性；

16：与培养的菌株表型不匹配；42个基因不太可能来自实验室培养的物种。

42：不太可能来自实验室培养的物种；

56：可能来源于正常菌群

所开发的抗性基因检测方法的特异性和灵敏度尚未确定，因为这需要对所有细菌(病原体和共生体)进行分离和测序—这是一项令人望而却步的任务。

7) 根据参考基因组组装：

临床宏基因组学数据也可用于组装病原体基因组以供参考实验室分型。

1. 宿主DNA去除的S16样品：在测序的前2小时内，具有47.9倍的基因组覆盖率，具有28个contigs，测序48小时后，基因组覆盖率增加至228.7倍，最终组装由22个contigs组成；

   宿主DNA未去除的S16样品：在测序的前2小时内，具有3.9倍的基因组覆盖率，具有69个contigs，测序48小时后，基因组覆盖率增加至17.5倍，最终组装由33个contigs组成；

2. 宿主DNA去除的S1样品：在测序的前2小时内，具有33.5倍的基因组覆盖率，具有83个contigs，测序48小时后，基因组覆盖率增加至165.7倍，最终组装由72个contigs组成；

   宿主DNA未去除的S1样品：在测序的前2小时内，具有0.2倍的基因组覆盖率，测序48小时后，基因组覆盖率增加至1.1倍。

8) 时间点分析：

通过此方法生成的宏基因组数据的质量/深度可以直接从临床样本实时监测病原体的出现和患者与患者之间的传播以及抗菌素耐药性。

在测序的5分钟内，去除宿主DNA的S16样品具有1.6倍的基因组覆盖率，而未去除宿主DNA的对照的覆盖度为0.2倍；

5分钟后在未去除宿主DNA的样品中未检测到mecA基因，而在相同的时间点在去除宿主DNA的样品中检测到两个mecA基因alignments。

在测序的20分钟内，去除宿主DNA的S1样品具有5.7倍的基因组覆盖率，而未去除宿主DNA的对照的覆盖度为0.06倍；

在测序的2小时内未检测到未去除宿主DNA的样品中的blaTEM和dfrA17基因，并且仅检测到一个针对sul1的alignment。相反，在去除宿主DNA的样品中在测序的20分钟内检测到所有三种抗性基因，并且在2小时后，检测到47个blaTEM，37个sulf1和21个dfrA17 alignments。

强调了去除宿主DNA在快速诊断病原微生物和抗性基因中的重要性。

本研究报告了利用Nanopore技术快速(6h)诊断病原体和抗生素抗性基因的宏基因组学流程。此外，通过额外的测序时间(最多48h)，可以为公共健康和感染控制应用提供足够的数据。